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Evolucion de la Ingenieria Genetica Historia y Cronología de Avances

Evolución de la Ingeniería Genética y Cronología de los Avances

Los avances científicos del siglo xx han sido prolíficos y variados, ellos fueron, son y serán determinantes para mejorar la calidad de vida de los hombres del mundo.

Muchos recordarán este período por la llegada del hombre a la Luna y la conquista del espacio exterior, la invención de las computadoras, los trasplantes de órganos o los bebés de probeta.

El recorrido por los hechos más sobresalientes de este siglo muestra que los logros en Genética y Biología molecular son altamente significativos y que tendrán notable incidencia en la curación de importantes enfermedades.

Por esa razón, elegimos denominarlo «el siglo de oro de la Genética».

La Teoría de la Genética:

A mediados del siglo XIX, la teoría de la evolución por selección natural, expuesta por Charles Darwin en su obra El origen de las especies (1859), suscitó encendidas controversias.

A principios del siglo XX, los ánimos se habían serenado y los biólogos comenzaban a interesarse más por los mecanismos de la evolución que por la validez de la teoría de Darwin.

El carácter hereditario de ciertos rasgos es un hecho reconocido desde los albores de la civilización, ya que los parecidos familiares constituyen una observación al alcance de todos.

Los criadores de ganado han aprovechado desde tiempos remotos este fenómeno para mejorar la calidad de sus animales.

Pero hasta fines del siglo XIX, los métodos utilizados eran totalmente empíricos.

Por ejemplo, Robert Bakewell, famoso criador inglés del siglo XVIII, obtenía excelentes resultados por el procedimiento de cruzar a sus animales con otros no emparentados para conseguir los rasgos deseados y cruzar posteriormente entre sí a los animales así obtenidos con el fin de estabilizar los caracteres conseguidos.

La genética no surgió como ciencia hasta 1900, pero sus fundamentos habían sido sólidamente establecidos 40 años antes por Gregor Mendel, monje moravo del monasterio de Brno.

Entre 1851 y 1853, su orden lo envió a Viena a estudiar ciencias y, al regresar al monasterio (del que llegó a ser abad en 1868), inició una serie de experimentos con la planta del guisante (Pisum).

Estudió siete características específicas de esta planta, entre ellas, la forma de la semilla, el color de las flores y la longitud del tallo.

TEMAS TRATADOS:

La Célula Célula Madre Los Genes y Genoma Estructura ADN La Oveja Dolly La Clonación
Terapia Genética La Biotecnología

Llevando detallados registros sobre más de 20.000 ejemplares, descubrió que estas características eran hereditarias en un coeficiente aproximado de 1:3.

El cruzamiento de plantas de tallo largo con ejemplares de tallo corto daba como resultado plantas de uno u otro tipo, nunca de altura intermedia.

Mendel supuso entonces que estas características eran transmitidas por factores hereditarios específicos que estaban localizados en las células germinales.

Sus ideas eran básicamente correctas pero, por desgracia, pasaron inadvertidas ya que sólo se publicaron en el periódico de la Sociedad de Historia Natural de Brno.

Decepcionado, envió una copia de su trabajo al destacado botánico suizo Karl von Nágeli (1817-1891), que no fue capaz de reconocer su importancia.

El hecho fue tristemente irónico, ya que el propio Nágeli, en 1842, había descrito minuciosamente el proceso de formación del polen en la familia de las azucenas, las liliáceas, y en sus apuntes había indicado la separación en el núcleo de lo que denominó «citoblastos transitorios», que eran en realidad los cromosomas, portadores de los «factores hereditarios» (genes) de Mendel.

Se perdió así una gran oportunidad.

En 1900, dieciséis años después de la muerte de Mendel, el botánico holandés Hugo de Vries publicó los resultados de una larga serie de experimentos de reproducción vegetal, en los que también obtuvo un coeficiente de 1:3.

Al publicar sus trabajos, citó las investigaciones de Mendel, realizadas treinta y cuatro años antes.

En pocas semanas, otros dos botánicos, C.E. Correns en Alemania y E. Tschermak von Seysenegg en el Imperio Austrohúngaro, publicaron resultados similares.

De esta forma, el nuevo siglo comenzó con la confirmación de los coeficientes de Mendel, que sentaron una sólida base para la teoría genética.

En Estados Unidos, el zoólogo T.H. Morgan comenzó a estudiar la evolución y la herencia en 1903.

Al principio, los resultados de Mendel le inspiraban escepticismo, pero sus investigaciones con la mosca de la fruta, Drosophila (un sujeto experimental particularmente conveniente, ya que se reproduce con rapidez y presenta cromosomas gigantes en las células de las glándulas salivales), muy pronto lo convencieron.

Llegó a la conclusión de que los genes, dispuestos en los cromosomas como las cuentas en un collar, eran las unidades de la herencia, y en 1911 publicó con sus colaboradores el primer «mapa cromosómico», en el que aparecía la localización de cinco genes ligados al sexo.

Diez años más tarde, más de 2.000 genes habían sido localizados.

En 1900 se aceptaron las leyes de la herencia que Johan Gregor Mendel había hecho públicas en 1865.

En 1953,James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura del ácido desoxirribonucleico (ADN), la llamada «molécula de la herencia», que contiene las instrucciones necesarias para crear un ser vivo.

La publicación de su artículo en la revista Nature, en 1953, fue el punto de partida de una revolución científica todavía en curso.

En 1973 nació la ingeniería genética, al conseguir transplantar material genético de un organismo a otro.

La lista de organismos creados a medida –y patentados– se amplió año tras año: una bacteria que devoraba el petróleo (1980), ratones que pesaban el doble de lo normal (1982) o un tomate con el proceso de maduración ralentizado (1987).

Con la oveja Dolly, se popularizaron los clones, organismos genéticamente iguales a otro.

En 2003 se consiguió el desciframiento completo del genoma humano, la cadena de ADN que contiene nuestras instrucciones genéticas.

Se concluyó que de los 3.120 millones de datos que lo componen, el 99,8% de ellos es idéntico para todas las personas, dato que invalidó definitivamente el criterio discriminador de raza.

Revelaba también que tenemos en torno a los 30.000 genes, poco más del doble que una mosca, 300 genes más que los ratones y muchos menos que el arroz.

Lo que nos hace distintos, pues, no es la cantidad sino la interacción entre los genes.

Con el desciframiento del genoma, se inauguró una nueva era de la medicina, con aplicaciones todavía impredecibles en la detección, prevención y tratamiento de enfermedades.

Si la responsabilidad social del científico ya era un tema debatido cuando estudiaba materia inorgánica, más lo es en la actualidad, cuando en el laboratorio se crean seres vivos y se experimenta la clonación humana.

Otro debate abierto es la relación entre ciencia y empresa.

En el pasado, la ciencia se ha beneficiado del intercambio de información, de la búsqueda desinteresada del conocimiento como un fin en sí mismo, del trabajo competitivo pero altruista de universidades y centros públicos.

Hoy, las leyes del mercado rigen el mundo científico, especialmente en los EE.UU., líderes absolutos en investigación.

Las empresas invierten lo que no invierten los estados pero sus legítimos intereses económicos condicionan el avance científico, incluso en el ámbito público, e impiden la libre circulación del conocimiento.

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CRONOLOGIA DE LA EVOLUCIÓN CIENTÍFICA

Entre todos los acontecimientos seleccionamos los siguientes:

1902. Hugo de Vries (botánico y genetista holandés, 1848-1935) descubre las mutaciones genéticas, cambios repentinos en los genes que se transmiten luego a la progenie.

1902. Ernest H. Starling (fisiólogo inglés, 1866-1927) y William M. Baylss (fisiólogo británico, 1860-1924) aislan la primera hormona sintética: la secretina.

1902-1909. Walter S. Sutton (genetista norteamericano, 1877-1916) y Thomas H. Morgan (genetista norteamericano, 1866-1945) descubren que las partículas que transmiten la herencia (genes) están ubicadas en los cromosomas.

1905. Albert Einstein (físico suizo-alemán, 1879-1955) publica su trabajo acerca de la teoría de la relatividad. «En ciertas condiciones extremas la masa se transforma en energía.»

1913. Alfred H. Sturtevant (genetista estadounidense, 1891-1970) comienza a construir mapas cromosómicos.

1914. Luis Agote (médico argentino, 1868-1954) logra que la sangre pueda mantenerse en estado líquido fuera del cuerpo al agregarle un anticoagulante: el citrato de calcio.

1923. Frederick G. Banting (médico canadiense. 1891-1941) recibe el Premio Nobel de Medicina y Fisiología porque logró aislar la insulina, hormona que regula el metabolismo de la glucosa y que se utiliza hoy en día en el tratamiento de la diabetes.

1927. Hermann J. Muller (biólogo norteamericano, 1890-1967) descubre que la exposición a los rayos X incrementa la tasa de mutaciones.

1928. Alexander Fleming (bacteriólogo escocés, 1881-1955) descubre accidentalmente la penicilina.

1937. Theodosius Dobzhansky (genetista estadounidense, 1900-1975) establece la vinculación entre los mecanismos de la herencia y la selección natural, dando origen a la teoría sintética de la evolución.

1947. Bernardo A. Houssay (médico argentino. 1887-1971) obtiene el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por sus investigaciones sobre la función de la glándula hipófisis en la regulación del metabolismo de los azúcares.

1953. James D. Watson (bioquímico norteamericano, n. 1928) y Francis H. C. Crick (físico inglés, n. 1916) presentan la estructura molecular del ADN. base de la reproducción de todas las formas de vida. Por su hallazgo, en 1962 reciben el Premio Nobel de Medicina y Fisiología. 1965. Christian N. Barnard (médico sudafricano, n. 1922) realiza el primer trasplante de corazón humano.

1965. Los biólogos franceses Francois Jacob (n. 1920), André-Michel Lwoff (n. 1902) y Jacques-Lucien Monod (1910-1976) comparten el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por sus descubrimientos relacionados con la genética de los procariotas.

1969. Los microbiólogos norteamericanos Max Delbrück (1906-1981), Salvador E. Luria (n. 1912) y Alfred Day Hershey (n. 1908) comparten el Premio Nobel por sus descubrimientos vinculados con el mecanismo de replicación y la estructura genética de los virus.

1969. El astronauta norteamericano Neil A. Armstrong (n. 1930) es el primer hombre que pisa el suelo de la Luna. El 20 de julio. Armstrong y su compañero Edwin E. Aldrin (n. 1930) posan el módulo lunar Apolo XI en la superficie lunar, mientras Michael Collins (n. 1930) permanece en órbita en torno del satélite.

1970. Luis F. Leloir (bioquímico argentino. 1906-1987) recibe el Premio Nobel de Química por descubrir el papel de un nuevo tipo de complejos esenciales para la vida animal y vegetal como el glucógeno, la celulosa y el almidón.

1973. Konrad Z. Lorenz (médico y naturalista austríaco, 1903-1989) es galardonado con el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por su estudio de la conducta de los animales y la introducción del término Etología. premio compartido con Karl R. von Frisch (zoólogo alemán, 1886-1982) y Nikolaas Tinbergen (zoólogo holandés, 1907-1988).

1981. Barbara McClintock (química estadounidense, 1902-1992) recibe el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por sus estudios de mapeo ci-tológicos en los que observó inactivación de genes por el movimiento de elementos génicos de un lado al otro de los cromosomas.

1984. César Milstein (bioquímico argentino, n. 1927) recibe el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por su descubrimiento acerca de los principios que rigen la producción de los anticuerpos monoclonales. Este descubrimiento es utiliz: por la Medicina para la elaboración de vacunas y el diagnóstico de enfermedades como el cáncer.

1987. Susumu Tonegawa (bioquímico japones n. 1927) recibe el Premio Nobel de Medicina y Fisiología por demostrar que segmentos de ADN separados codifican porciones variables de moléculas de los anticuerpos, iniciando de esta manea una serie de descubrimientos en relación con el funcionamiento del sistema inmune.

1990. Los doctores estadounidenses W. French Anderson, R. Michael Blaese y K. Culver, del Instituto Nacional de Sanidad de Bethesda, realizar, con éxito la primera terapia génica en una niña de cuatro años, Ashanti De Silva, que padecía inmunodeficiencia combinada grave, una enfermedad hereditaria mortal.

1997. Un equipo científico del Instituto Roslin. de Escocia, dirigido por el doctor Ian Wilmut. crea una oveja por clonación a partir del núcleo celular de la ubre de su progenitura y del citoplasma de un óvulo. Dolly, la primera oveja clonada, abre unnuevo camino en el campo de la Ingeniería genética y la Biotecnología, de resultados y consecuencias aún insospechados.

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INGENIERÍA GENÉTICA

Disciplina que se ocupa de «unir genes»; esto es, de sustituir un segmento de ADN de una célula por uno de otra (al organismo que surge de este proceso se lo denomina transgénico).

Hasta comienzos de la década de 1970 no se conocían técnicas adecuadas para manipular el ADN en tubos de ensayo.

Debido a ser las moléculas de ADN de gran tamaño, cuando se las intentaba fragmentar los cortes se producían al azar, con lo cual se descomponía la información genética contenida en ellas de forma tal que era prácticamente imposible de recomponer.

Sin embargo, a comienzos de esa década se encontraron herramientas moleculares que podían resolver muchos de esos problemas: enzimas capaces de cortar sólo por sitios determinados las moléculas de ADN; ligasas capaces de reunir con precisión molecular los fragmentos y sellar las uniones para dejarlas perfectamente reparadas, y un gran número de otras enzimas capaces de cortar, modificar, multiplicar y recomponer el ADN (se habla de ADN recombinante), lista es la tecnología conocida como ingeniería genética.

Por medio de ella se pueden seleccionar no ya individuos, sino algunos de sus genes o porciones de ellos.

Se puede, en definitiva, crear algo absolutamente nuevo: nuevas moléculas vivientes, nuevos genes y por tanto nueva vida.

Y existen otros procedimientos, más recientes, que introducen importantes novedades.

Desde finales de la década de 1980 y comienzos de la de 1990 existe la posibilidad de generar animales a los cuales se les puede eliminar un determinado gen.

No se trata, pues, de animales transgénicos, sino de estirpes (de ratones, por ejemplo) carentes de un determinado gen, lo que permite precisar cuál es la verdadera función de ese gen, sin más que estudiar las deficiencias que presenta el animal.

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Las técnicas  de ingeniería genética pueden utilizarse para diagnosticar enfermedades genéticas, detectar infecciones virales y bacterianas o determinar la identidad del sospechoso de un crimen.

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Las Técnicas de Ingeniería Genética,

se basan en el ADN recombinante, formado por moléculas de ADN que se originan en dos o más organismos (o virus) diferentes.

En general, tienen un denominador común: en todas se manipula el material genético (ADN) de dos o más especies diferentes.

Estas técnicas, desarrolladas hace menos de treinta años, revolucionaron todas las áreas de investigación y de aplicación tecnológicas.

Tuvieron una enorme influencia en el diagnóstico y en el tratamiento de distintas enfermedades, así como en el agro y en la industria, pues con ellas desarrollaron microorganismos, plantas y animales de crecimiento más rápido, de mejor rendimiento nutritivo, etc.

Se utilizaron, por ejemplo, para la fabricación de antibióticos y para lograr una mayor resistencia a los herbicidas.

Las principales «herramientas moleculares» que se emplean para obtener ADN re-combinante son, además de la secuenciación del ADN y de la clonación ya estudiadas, las enzimas de restricción y la reacción en cadena de la polimerasa.

• Las enzimas de restricción actúan a la manera de «tijeras» moleculares, y segmentan el ADN en puntos específicos de la cadena, es decir, son capaces de fragmentar el genoma.

Una de las utilidades de dichas enzimas es que permiten localizar los genes responsables de las distintas enfermedades hereditarias que afectan al hombre.

Por medio de ellas, se obtienen fragmentos de ADN, los cuales pueden insertarse en el interior del ADN de vectores («vehículos moleculares») presentes en las bacterias: los plásmidos.

Esta nueva molécula de ADN es el ADN recombinante.

Así, resulta posible, por ejemplo, introducir en un plásmido bacteriano el gen que codifica la producción de la insulina humana.

• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método que permite obtener, en poco tiempo, muchísimas copias de un fragmento de ADN particular. Fue desarrollado en 1983 por el bioquímico norteamericano Kary Mullís, a quien diez años después se lo distinguió con el Premio Nobel por esta invención.

Para realizar la PCR, sólo hace falta conocer una parte de la secuencia del fragmento que se desea amplificar.

La sensibilidad del método es tal que una pequeñísima fuente de ADN, como la contenida en una gota de sangre o esperma o en la raíz de un cabello, basta para realizar el análisis.

Las aplicaciones de estas dos técnicas son innumerables: pueden utilizarse para diagnosticar enfermedades genéticas, detectar infecciones virales y bacterianas o determinar la identidad del sospechoso de un crimen, además de ser herramientas fundamentales en los laboratorios de investigación.

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esquema obtencion de insulina reconbinante
Obtención de insulina recombinante: A: Los genes de la insulina humana son introducidos en un plásmido bacteriano detrás del gen bacteriano de la galactosidasa, y quedan así incorporados en su dotación génica. B: Cuando los genes que regulan la producción de insulina incorporados a genoma de la bacteria se expresan, el microorganismo comienza a generar insulina idéntica a la humana.

Método de Relajación Ocular de Bates-Grandes Cientificos Desconcoidos

Método de Relajación Ocular de Bates

William Horatio Bates (1860-1931)
William Horatio BatesWilliam Horatio Bates ejerció una gran influencia sobre miles de personas con serios defectos oculares a principios de este siglo, con su idea de que las gafas eran simples «muletas para ojos» y podía prescindirse de ellas.

Su sistema de «relajación ocular» se suele considerar hoy inútil y sus teorías dignas de un charlatán.

Sin embargo fue la primera figura importante de la tendencia moderna a sustituir las gafas por ejercicios oculares para tratar los defectos visuales

Bates nació en Newark, Nueva Jersey, se graduó en Cornell en 1881 y recibió su título de Medicina en el Colegio de Médicos y cirujanos, en 1885.

Fue ayudante clínico en el Hospital de Ojos y  Oídos de Manhattan y médico residente en el Hospital Bellevue y más tarde en la Enfermería de los Ojos de Nueva York.

Desde 1886 a 1891 Bates, especialista en ojos, oídos, nariz y cuello, enseñó oftalmología en la Escuela Médica de Postgraduados y Hospital de Nueva York.

Luego empezó una serie de misteriosos acontecimientos.

En 1902 desapareció.

Unos meses después su mujer supo que estaba trabajando en un hospital de Londres.

Cuando acudió a su lado lo encontró en un estado de agotamiento y sin poder recordar lo sucedido.

Dos días después desapareció de nuevo.

La señora Bates buscó a su marido por toda Europa sin éxito.

Regresó a los Estados Unidos y continuó su infructuosa búsqueda hasta su fallecimiento.

Un colega oculista lo descubrió, en 1910, practicando en Grand Forks, Nueva Dakota, donde residía desde hacía seis años.

Se persuadió a Bates para que regresara a Manhattan y trabajó como médico residente en el Hospital de Harlem hasta 1922.

En 1920 publicó por cuenta propia un libro titulado Curación de la vista defectuosa mediante el tratamiento sin gafas (Cure of Imperfect Eyesight by Treatment wiihout Glasses), un «compendio fantástico», según un biógrafo de Bates, «de casos extravagantemente exagerados, inferencias injustificadas e ignorancia anatómica».

El Método de relajación ocular de Bates, pues éste es el nombre del remedio, se basa en su teoría de la acomodación, es decir, del proceso que tiene lugar dentro del ojo cuando mira un nuevo objeto a mayor o menor distancia.

Bates creía que la causa de todos los errores refractivos, como miopía, presbicia y astigmatismo, era simplemente el «esfuerzo», debido a su vez a un «estado anormal de la mente».

El bizqueo u otra perturbación funcional del ojo, por ejemplo, no es más «que un pensamiento equivocado y su desaparición es tan rápida como el pensamiento que relaja. Si la relajación es sólo momentánea, la corrección es momentánea. Cuando se hace permanente, la corrección es permanente».

El sistema de Bates supone una «fijación central», es decir, aprender a ver sin esfuerzo.

Los pacientes aprendían primero a «tapar» cubriendo ambos ojos con las palmas de las manos y tratando de pensar en un «negro perfecto».

Bates creía que cuando un paciente era capaz de ver una negrura pura, se producía una mejora inmediata de la vista.

El paciente aprendía luego el «desplazamiento» y el «balanceo».

Al decir desplazamiento, Bates se refería a un movimiento hacia adelante y hacia atrás hasta que se creaba la ilusión de un objeto balanceándose a un lado y a otro.

Se recomendaba a los  pacientes cuanto más corto fuese el desplazamiento mayores serían los efectos benéficos.

Además de tapar, desplazar y balancear, Bates recomendaba también reforzar los ojos leyendo en condiciones especialmente difíciles.

Se explicaba también a los pacientes que sus ojos se reforzarían mirando directamente al Sol breves instantes, para que los rayos beneficiosos pudiesen bañar la retina, sistema que según la mayoría de médicos puede causar con facilidad daños permanentes en la retina.

Bates aseguraba también que el bizqueo, las manchas en los ojos e incluso el parpadeo de las estrellas se debían a los esfuerzos del ojo.

Los físicos sostienen, en general, la idea de que el parpadeo de las estrellas se debe al paso de corrientes de aire de distintas densidades, pero Bates aseguraba que el parpadeo estaba totalmente dentro de nuestra mente.

El parpadeo cesa cuando los ojos dejan de esforzarse, decía.

«No sólo desaparecen todos los errores de refracción y todos los trastornos funcionales del ojo cuando éste ve mediante la fijación central, también quedan aliviadas muchas situaciones orgánicas», declaraba Bates.

Según su obra, estados físicos como la glaucoma, el principio de catarata y la iritis sifilítica (inflamación del iris del ojo) «desaparecen cuando se ha conseguido la fijación central.

Se consigue a menudo una mejora en pocos minutos y en casos raros la mejora es permanente.

También se benefician con el sistema infecciones y enfermedades causadas por las toxinas de la fiebre tifoidea, gripe, sífilis y gonorrea.

Aunque entre en el ojo un cuerpo extraño, si se mantiene la fijación central no se produce enrojecimiento ni dolor».

Bates enseñó su método a centenares de discípulos.

Surgieron cu todo el territorio muchos «estudios»: así llamados porque para dirigir una «clínica» se necesitaba el título de médico.

Quizás uno de los maestros más conocidos que estudió con Bates fue la señora Margaret Darst Corbett, de Los Angeles, quien se enfrentó con éxito a una denuncia por parte de los oculistas, optometristas y oftalmólogos colegiados de California del Sur por «practicar la medicina y la optometría sin licencia».

La sala del tribunal se llenó de testigos con edades comprendidas entre 5 y 85 años que, según decían, habían recuperado la vista normal gracias a las lecciones de la señora Corbett.

Sólo en Los Ángeles se ofrecieron 500 personas para testimoniar en favor de la señora Corbett.

En su defensa dijo simplemente que no era médico. Era maestra. «Normalizo los ojos mediante la relajación» declaró la señora Corbett, «no diagnostico ni prescribo ni medico.»

Si existe la posibilidad de un estado patológico, envío a los clientes a sus propios médicos para que los examinen y diagnostiquen. Yo enseño que cuando una persona tiene algo de vista puede desarrollar más, no con ejercicios, empujones, o esforzando todavía más unos ojos cansados, ni tampoco utilizando unos lentes fuertes, sino dejando a los ojos cómodos y relajados, dejándoles ver, sin obligarlos más».

La señora Corbett, que falleció el 2 de diciembre de 1962, ganó el juicio porque demostró que mejoraba la visión deficiente únicamente mediante la relajación.

Entre los convertidos más eminentes de Bates, están el auto-titulado experto en cuestiones de sanidad Bernarr Mac Fadden y el escritor Aldous Huxley, víctima de una temprana infección ocular que dejó sus córneas con cicatrices permanentes.

Huxley se hizo seguidor del Método Bates y confesó que este método había beneficiado mucho su vista.

Más tarde (1942) escribió un libro El arte de ver (The Art of Seeing) que resumía las teorías de Bates e incluía otras formas de terapia inspiradas en el mismo Huxley.

Bates falleció el 10 de julio de 1931 en la ciudad de Nueva York, pero sus teorías y métodos excéntricos continuaron siendo populares.

Llegó a haber hasta 50 maestros en la zona de Los Ángeles trabajando con pacientes y enseñando el Método Bates.

En la actualidad, aunque existen algunos estudios en Los Andeles y dos en San Francisco, sólo hay uno en San Diego, uno en Kansas City y uno en Nueva York; este último sólo acepta clientes enviados por un médico.

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